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RNA 和 DNA 提取實驗中的問題解決
點擊次數(shù):349 更新時間:2024-06-20

  RNA和DNA提取:
  
  裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
  
  Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
  
  洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。
  
  溶jun酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型,也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,實際上在這些變性緩沖液中效果較好;當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性增多,蛋白酶 K 的作用也會相應(yīng)增強。然而,溶jun酶在變性中不起作用,因此溶jun酶處理通常在添加變性鹽之前進(jìn)行。
  
  RNA和DNA提取實驗中的問題
  

  1.產(chǎn)量低
  
  如果您遇到的 DNA/RNA 產(chǎn)量低于您對樣品的預(yù)期,則需要考慮許多因素。通常,這是一個裂解問題。不完wan全裂解是產(chǎn)量低的主要原因。它也可能是由不正確的綁定條件引起的。確保使用新鮮的優(yōu)質(zhì)乙醇(100% 200 標(biāo)準(zhǔn))稀釋緩沖液或添加到結(jié)合的步驟。劣質(zhì)乙醇或舊庫存可能已經(jīng)吸收了水分,并且濃度不正確。如果洗滌緩沖液制備不正確,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。
  
  2.低純度
  
  如果提取的 DNA 被蛋白質(zhì)污染(低 260/280),那么您可能開始時樣品過多,而蛋白質(zhì)沒有完wan全去除或溶解。
  
  如果 DNA 的 260/230 比率不佳,則問題通常是結(jié)合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用最高質(zhì)量的乙醇來制備洗滌緩沖液,如果問題仍然存在,請再次洗滌色譜柱。
  
  與其他樣品相比,一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)純度問題,因為腐殖質(zhì)在提取過程中會被溶解。
  
  腐殖質(zhì)的行為與 DNA 相似,很難從硅膠柱中去除。
  
  3.降解
  
  降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在 RNA 提取過程中,樣品儲存不當(dāng)或裂解效率低等情況都會導(dǎo)致降解。對于 DNA 提取,降解不是一個大問題,因為對于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。
  
  PCR 清理時的注意事項
  
  PCR 凈化其實并不是 DNA 提取技術(shù)本身,但它是一種效率高且簡單的技術(shù),它只是添加高濃度的結(jié)合鹽(通常每體積 PCR 反應(yīng) 3-5 體積鹽)和離心來過濾。
  
  在實驗過程中,PCR Clean-up 試劑盒出現(xiàn)故障也會導(dǎo)致整個實驗功虧一簣。
  
  因為在PCR 反應(yīng)中有較多吸收 260 度紫外線的物質(zhì),比如:核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以,PCR 凈化試劑盒經(jīng)常無法正常工作可能是由于 PCR 反應(yīng)失敗所造一般成較難清理。

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